Главная / Наука / Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) — сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных — от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий — периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами — β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом — антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура — внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют — предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий — с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

  • На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель — генцианвиолет или метиленовый синий.
  • Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
  • Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
  • Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
  • Производят дополнительное окрашивание — докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
  • После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — розовый или красный.

  • Причины различного характера окрашивания

    Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

    Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными — окрашиваются грамотрицательно.

    После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

    Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

    К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

    Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

    Источник: bisbroker.ru